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RNA的免疫共沉淀分離及檢測
作者:管理員    發布于:2018-08-28 08:46:46    文字:【】【】【

非編碼RNA的發現使得RNA領域再次成為了生命科學研究關注的焦點。因為RNA是一種不穩定的生物大分子,絕大多數的RNA都需要與特定的RNA結合蛋白質結合形成RNA/蛋白復合物才能穩定存在于細胞中;不僅如此,RNA與RNA結合蛋白之間的動態關聯貫穿和伴隨了RNA的轉錄合成、加工和修飾、胞內運輸和定位、功能發揮及降解的整個生命循環。鑒于此,利用RNA結合蛋白分離或發現鑒定功能性RNA分子是RNA研究領域中一個不可或缺的研究方法。簡單地說,就是利用RNA結合蛋白的抗體免疫沉淀RNA/蛋白復合物,再從沉淀的RNA/蛋白復合物中分離得到特定RNA結合蛋白的RNA;分離得到的RNA可以通過末端標記和變性膠電泳對RNA分子的大小進行鑒定,也可以利用高通量RNA測序方法對RNA序列進行分析。

 

●全部所用的溶液試劑均經過DEPC處理或由DEPC水配制。

●RNA抽提過種中乙醇漂洗步驟可以省略。

●RNA樣品溶解與保存:TE(pH8。0)緩沖液。80℃(如果下一步操作涉及酶反應)100%de-ionicFormamide(如果下一步是電泳檢測)

●熟練的RNA操作非常重要。RNase的污染可通過使用RNAZap處理操作環境得到降低。

 

1.  由組織或細胞裂解液免疫沉淀RNP復合物

 

1)可預先UV照射組織和細胞固定RNA/結合蛋白復合物。

 

2)使用預先冰浴冷卻的PBS洗組織或細胞兩次。

 

3)將裂解液加入組織樣品中進行勻漿(細胞樣品勻漿步驟可省略)。裂解液:

25 mmol/L Tris-HClpH7.5,150 mmol/L KCl,2 mmol/L EDTA,0.5%NP40,1 mmol/L NaF,1 mmol/L DTT,100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制劑,EDTA-free蛋白酶抑制劑。

 

4)樣品裂解液在4℃下14000 r/min(16000 g)離心10 min,上清液將用于免疫沉淀。

 

5)將預平衡的ProteinA/GSepharosebeads與適量的抗體混勻,于4℃旋轉混勻6 h左右。

 

6)將第3步驟中準備的上清液樣品加入beads-抗體混合液中于4℃旋轉混勻6 h以上或過夜。結合時間也取決抗體本身的質量和效率。

 

7)將混勻液于4℃,1000 r/min離心10 s,棄上清液,用冰浴冷的低鹽漂洗液洗beads兩次,每次5 min,冰上或4℃進行。隨后再用高鹽漂洗液洗beads兩次,每次5 min,冰上或4℃進行。低鹽漂洗液:(高鹽漂洗液使用300 mmol/L的NaCl)50 mmol/L Tris-HClpH7.4,150 mmol/L NaCl(300 mmol/L),1 mmol/L MgCl2,0.05%NP40,2 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制劑。

 

2.  小分子RNA的抽提

1)用ProteinaseK溶液重懸beads,55℃消化10 min。

2)再用常規的TRizol法抽提RNA,用乙醇沉淀。

 

3.  RNA5'端標記和電泳檢測

1)用CalfIntestinalPhosphatase處理抽提得到的RNA,以去掉5'端磷酸基團。

 

2)經酚氯仿抽提和乙醇沉淀后,使用γ-32PATP標記RNA分子的5'末端。

 

3)將標記后的RNA分子通過15%聚丙烯酰胺尿素變性膠進行電泳分離,隨后經放射自顯影進行檢測。

 

4.  Solexa高通量RNA測序

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